Ingeniería Genética (1401), 2012/13

AUTORES:

Jose Luis Micol Molina
María Rosa Ponce Molet
Hector Candela Anton

Depto. Biología Aplicada

Área Genética

Esta asignatura se ha impartido en
Grado en Biotecnología, curso 2012-2013

Métodos de estudio de la estructura y función de los genes. Métodos de manipulación y transferencia de genes.

Tipo de materiales

Apuntes-teoría Práctica Prácticas resueltas Ejercicios Ejercicios resueltos Proyectos Estudios de casos Exámenes Autoevaluación Seminarios Presentaciones

Formato de los documentos

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Descripción

Los materiales aquí contenidos son parte de los materiales de apoyo al aprendizaje facilitados a los estudiantes durante el curso 2012/13 en la asignatura 1401 de título Ingeniería Genética.

En particular, corresponden a:

Apuntes-teoría Práctica Prácticas resueltas Ejercicios Ejercicios resueltos Proyectos Estudios de casos Exámenes Autoevaluación Seminarios Presentaciones

Nombre de Asignatura		Código	CT	CP	CTOT
INGENIERÍA GENÉTICA		1401	3	3	6
Tipo		Cuatrimestre	Primero	Curso	2
Descripción	Métodos de estudio de la estructura y función de los genes. Métodos de manipulación y transferencia de genes.
Departamento	BIOLOGÍA APLICADA
Área	GENÉTICA
Grado	GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
Centro	FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

Objetivos de aprendizaje

Los objetivos de aprendizaje globales en la asignatura en que se integran los recursos desarrollados son los siguientes. Aparecen resaltados aquellos vinculados a los materiales disponibles en el OCW-UMH.

1. Familiarización con las técnicas que permiten la caracterización y manipulación de los ácidos nucleicos
2. Capacidad de comprender y enjuiciar los avances recientes en Ingeniería Genética
3. Capacidad de interpretar los experimentos de Genética Molecular y de Ingeniería Genética que se presentan en una selección de artículos científicos.
4. Capacidad de diseñar experimentos sencillos de Genética Molecular e Ingeniería Genética, empleando una mentalidad científica
5. Capacidad de comprender la utilidad de las enzimas más importantes para las técnicas de Ingeniería Genética, especialmente las polimerasas, ligasas y restrictasas
6. Aprendizaje de las distintas estrategias de clonación, construcción de genotecas, hibridación y secuenciación de ácidos nucleicos
7. Aprendizaje de la técnica de la PCR, sus aplicaciones y su trascendencia en muchos campos de la Biología
8. Comprensión de las técnicas que permiten la caracterización estructural y funcional de los genes, así como las que posibilitan su perturbación controlada

Contenidos

Los contenidos globales de la asignatura en que se integran los recursos desarrollados son los siguientes. Aparecen resaltados aquellos vinculados a los materiales disponibles en el OCW-UMH.

1.Introducción a la Ingeniería genética

Descripción: Con los contenidos del Tema 1 se pretende dar una visión panorámica de la Genética y recordar algunos conceptos básicos e indispensables para seguir la asignatura. En primer lugar se hace una crónica del proceso que llevó al descubrimiento de la naturaleza molecular del material genético, desde los experimentos de Mendel a la dilucidación de la estructura secundaria del ADN. Se describen brevemente los procesos de expresión génica y se recuerda el ¿Dogma central de la Biología molecular¿. Se explica el código genético, sus propiedades y algunos de los experimentos que permitieron su dilucidación. Finaliza el tema con una breve historia de la Genética, con alusiones a la trascendencia social de los descubrimientos en el campo, así como una reflexión acerca de las controversias que ha despertado en numerosas ocasiones la Genética en la sociedad.

Temas:

1.1.TEMA 1: GENÉTICA, GENES E INFORMACIÓN GENÉTICA La Genética. Concepto clásico y moderno de gen. La información genética. Experimentos clave en la determinación de la naturaleza molecular del material hereditario. Componentes estructurales del ADN. Los experimentos de Chargaff, Franklin y Wilkins y el modelo de la doble hélice de Watson y Crick. Consecuencias del modelo de la doble hélice: Polaridad y complementariedad de las cadenas del ADN; el mecanismo de replicación del ADN. Flujo de la información genética. El genoma, el transcriptoma y el proteoma. El dogma central de la Biología molecular. El código genético. Propiedades del código genético. Experimentos clave en la dilucidación del código genético. Partes de la Genética: Formal, Molecular y de Poblaciones. Los orígenes de la Genética: los experimentos de Mendel. Las herramientas de la Genética: Los sistema modelo, los mutantes y los procedimientos de la Ingeniería genética. Relación de la Ingeniería genética con la Genética molecular. Algunas aplicaciones de las técnicas de la Ingeniería genética. Logros y reconocimientos sociales relacionados con la Genética molecular y la Ingeniería genética. Controversias relacionadas con la Genética: la eugenesia y la manipulación genética.

Sesiones prácticas:

1.1.Resolución de 3 problemas

2.Herramientas de la Ingeniería genética

Descripción: Esta unidad temática abarca los temas 2 y 3. La enzimología de la Ingeniería genética se describe en el Tema 2, haciendo hincapié en las endonucleasas de restricción, las ligasas y las polimerasas de ADN. Se ahonda en la descripción de las endonucleasas de restricción de tipo II, que junto a las ligasas fueron claves en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante. Se tratan las polimerasas de ADN y ARN y se explica la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En el Tema 3 se presentan los experimentos pioneros de la tecnología del ADN recombinante en las Universidades californianas de San Francisco y Stanford, que aceleraron el desarrollo de la Ingeniería genética. A continuación se explican los sistemas de vectores y su evolución. Se discute acerca de las ventajas e inconvenientes de los distintos sistemas hospedadores, tanto procarióticos como eucarióticos.

Temas:

2.1.TEMA 2.- ENZIMOLOGÍA DE LA INGENIERÍA GENÉTICA Principales grupos de herramientas, métodos y productos de la Ingeniería genética. Nucleasas de cadena sencilla y doble, de ARN y de ADN, exonucleasas y endonucleasas. Sistemas de restricción-modificación. Endonucleasas de restricción de tipo II, frecuencia de corte y extremos generados. Purificación de ADN y ARN. Visualización de los ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel. Cartografía de restricción. Protección por metilación. Enzimas modificadoras de los extremos de los ácidos nucleicos: Fosfomonoesterasas y Polinucleótido quinasas. Ligasas de ADN. Polimerasas de ADN dependientes de ADN. Enzimas termoestables. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Criterios para el diseño de cebadores para la PCR. Características de algunas polimerasas termoestables. Polimerasas con actividad correctora de pruebas y fidelidad de copia. La actividad desoxinucleotidil transferasa terminal de algunas polimerasas termoestables. Polimerización en ausencia de molde. Polimerasas de ARN dependientes de ADN. Las retrotranscriptasas: Polimerasas de ADN dependientes de ARN.

2.2.TEMA 3.- SISTEMAS DE VECTORES Y HOSPEDADORES Clonación in vitro y celular de moléculas de ADN. Vectores para el mantenimiento del inserto y para su expresión. Sistemas de hospedador-vector basados en Escherichia coli: Las células hospedadoras. Propiedades generales de Escherichia coli como hospedador. Algunos ejemplos de estirpes de Escherichia coli útiles en Ingeniería genética. Los plásmidos de Escherichia coli. Obtención de las primeras moléculas de ADN recombinante: los experimentos pioneros de Cohen, Boyer y Berg. Sistemas de hospedador-vector basados en Escherichia coli: Vectores plasmídicos. Evolución de los vectores plasmídicos: modificaciones para incorporar marcadores seleccionables, sitio de clonación múltiple y para la transcripción in vitro del inserto. Vectores combinados de plásmidos y fagos. Cósmidos. Fásmidos. Vectores de gran capacidad: Cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Otros sistemas de hospedador-vector procarióticos. Vectores lanzadera. Limitaciones de los organismos procariotas para la expresión de genes eucariotas: la producción de humulina. Sistemas eucarióticos de hospedador-vector basados en levaduras. Sistemas eucarióticos de hospedador-vector basados en células y virus de animales. Sistemas eucarióticos de hospedador-vector basados en células vegetales y sus agentes infecciosos.

Sesiones prácticas:

2.1.3 sesiones de resolución de problemas. En cada sesión se resolverán y discutirán 3 problemas

2.2.Práctica de laboratorio en la que se cultivará el fago lambda de Escherichia coli en placas de Petri y en medio líquido

2.3.Práctica de laboratorio en la que se purificará el genoma del fago lambda y se someterá a restricción, para su uso ulterior como marcador de peso molecular, y los resultados se visualizarán mediante electroforesis en un gel de agarosa.

3.Métodos de la Ingeniería genética

Descripción: Esta unidad temática comprende los temas 4-8 del temario. El Tema 4 se dedica a los métodos de manipulación del ADN, describiendo los distintos tipos de insertos, el ensamblaje de construcciones, los procedimientos y las estrategias de clonación, la obtención de genotecas y algunas variantes de la PCR relacionadas con la tecnología de la clonación. Por último se explica la metodología Gateway como alternativa a la utilización de restrictasas y ligadas para la generación de moléculas recombinantes.

Los Temas 5 y 6 se dedican a la caracterización estructural del ADN. Se discuten los procedimientos de definición de la anatomía general y fina de una molécula de ADN. En el Tema 5 se explican las bases de los métodos de hibridación de ácidos nucleicos, en especial el ideado por Southern para la determinación del número de copias de una secuencia en un genoma. Se discuten las ventajas y limitaciones de la utilización del método de Southern y el de la PCR y se incide en la revolución metodológica que supuso el desarrollo de esta última.

En el Tema 6 se describen las técnicas de secuenciación, haciendo énfasis en la variante semiautomatizada del método de Sanger, mediante reacciones de secuenciación cíclica y detección fluorescente de los didesoxinucleótidos terminadores. Se exponen los métodos más novedosos de secuenciación a gran escala, conocidos como ¿métodos de la siguiente generación¿, que se impondrán al de Sanger en los próximos años. Se comentan también los procedimientos para la anotación de los genomas, mediante distintos tipos de análisis informatizado de las secuencias nucleotídicas.

En el Tema 7 se describen los procedimientos de determinación de los patrones de expresión de los genes en el tiempo y en el espacio, en sus variantes clásicas, como el método de Northern, o más actuales como la retrotranscripción seguida de amplificación mediante PCR (RT-PCR). Se discute la técnica de la PCR en tiempo real y sus aplicaciones para la cuantificación de ADN y ARN. A continuación se describen los métodos basados en la hibridación de micromatrices y su uso para el análisis de la expresión génica a gran escala. Se describen también las técnicas de hibridación in situ y las que implican la utilización de genes testigo para el análisis de la expresión espacial y temporal de los genes, así como la localización subcelular de sus productos. Termina el tema con el comentario de las técnicas para la identificación y análisis funcional de las secuencias reguladoras de los genes y las que permiten definir las interacciones entre proteínas.

La perturbación controlada de la actividad de los genomas se trata en el Tema 8, dedicado a la mutagénesis dirigida, cuyas diferencias con los procedimientos clásicos se comentan, detallando sus distintas modalidades, incluidas las de señalización y noqueo (knockout) de genes y los procedimientos indirectos de inactivación dirigida, como el uso de oligonucleótidos formadores de tríplices y los basados en el ARN interferente. Se abordan finalmente los procedimientos para la inactivación de la expresión génica a gran escala que se emplean más habitualmente en los organismos modelo.

Temas:

3.1.TEMA 4: PROCEDIMIENTOS DE CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE Estrategias para la obtención de insertos: Fraccionamiento de ADN genómico, síntesis de ADNc y amplificación mediante PCR. Ensamblaje de moléculas de ADN recombinante. Ligaciones de extremos cohesivos y romos. Modificaciones de los extremos de los insertos y el vector. Clonación de productos de PCR. Genotecas. Estrategias para la construcción de genotecas genómicas: métodos de fraccionamiento del ADN genómico y elección del vector. Construcción de genotecas de ADNc. La tecnología Gateway como alternativa al uso de endonucleasas de restricción y ligasas para la generación de moléculas recombinantes. Determinación del tamaño de un inserto mediante análisis de restricción y mediante PCR.

3.2.TEMA 5: CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE MOLÉCULAS DE ADN: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Métodos de hibridación de ácidos nucleicos: el método de Southern. Síntesis y detección de sondas. Aplicaciones del método de Southern y la PCR para el diagnóstico molecular. Polimorfismos en la longitud de secuencias: minisatélites y microsatélites. Obtención de la huella molecular mediante el método de Southern y la PCR. Escrutinio de genotecas. Micromatrices de ADN. El perfil genético de los individuos mediante hibridación con micromatrices. Perfiles genéticos y medicina personalizada. Detección de una secuencia en un cromosoma. Técnicas de hibridación in situ.

3.3.TEMA 6: CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE MOLÉCULAS DE ADN: SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE SECUENCIAS Principios generales de los procedimientos de determinación de la secuencia primaria de nucleótidos de una molécula de ADN. Secuenciación química. Secuenciación enzimática por el método de Sanger. Secuenciación semiautomatizada mediante detección fluorescente. Alternativas recientes al método de Sanger. Pirosecuenciación. Ultrasecuenciación. La era de la Genómica. Mapas genéticos y físicos. Tipos de marcadores para la generación de mapas. Estrategias de secuenciación de genomas completos: el método de clones ordenados y el de la perdigonada (shotgun). Análisis bioinformático de secuencias. Bases de datos biológicas. Identificación de pautas de lectura abiertas (ORF). Identificación de exones e intrones. Identificación de promotores, sitios de inicio de la transcripción y traducción, y señales de poliadenilación. Identificación de señales en el ADN y motivos en las proteínas. Búsqueda de homologías. Filogenias moleculares.

3.4.TEMA 7: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS GENES Y SUS PRODUCTOS Definición de patrones de expresión génica en el tiempo y en el espacio. Método de Northern. RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa (qRT-PCR). Criterios para el diseño de cebadores para la PCR tradicional, la RT-PCR y la qRT-PCR. Análisis global de la expresión génica. Caracterización de la fracción transcrita de un genoma: las EST. Hibridación con micromatrices. Secuenciación masiva de ADNc (RNAseq). Localización de los productos de la expresión de un gen. Técnicas de hibridación in situ. Genes testigo. Construcciones para la determinación del patrón de expresión espacial de genes y la localización subcelular de proteínas. Métodos para la localización de secuencias reguladoras. Retraso en gel. Footprinting con DNasa I. Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Técnicas combinadas para el análisis de secuencias reguladoras a nivel genómico: ChIP-chip y ChIP-seq. Demostración de interacciones físicas entre proteínas. El método del doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae. Coprecipitación de proteínas. Complementación fluorescente bimolecular. El sistema de un híbrido de levadura.

3.5.TEMA 8: PERTURBACIÓN CONTROLADA DE LA ACTIVIDAD DE LOS GENOMAS Genética ¿clásica¿ y Genética ¿inversa¿. Mutagénesis clásica. Mutagénesis dirigida. Mutagénesis al azar mediante PCR. Inactivación dirigida de genes. Mutagénesis insercional y señalización de genes. Estrategias de mutagénesis a gran escala. Terapia génica. Construcciones antisentido. Mutagénesis mediante ARN interferente. microARN artificiales. Síntesis de polipéptidos a partir de fragmentos de ADN clonados. Vectores y genotecas de expresión. Estrategias para la expresión de un gen eucariótico en un hospedador procariótico: maduración de los transcritos y proteínas eucarióticas. Uso de animales y plantas en Biotecnología molecular.

Sesiones prácticas:

3.1.7 sesiones de problemas de 1 hora de duración cada una. En cada sesión se discutirán 3 problemas.

3.2.2 sesiones de resolución de problemas. En cadas sesión se resolverán y discutirán 3 problemas

3.3.Prácticas de laboratorio en 3 sesiones consecutivas en las que se amplificará por PCR una región del genoma de un eucariota y se clonará en un vector plasmídico. Se transformará Escherichia coli y se seleccionarán transformantes.

Indicaciones Didácticas

Las indicaciones didácticas de la asignatura en que se integran los recursos desarrollados son las siguientes. Aparecen resaltados aquellos aspectos didácticos vinculados a los materiales disponibles en el OCW-UMH.

Metodología

La metodología de enseñanza-aprendizaje está fundamentada en:

Aprendizaje basado en problemas
Aprendizaje cooperativo
Estudio de casos
Expositivo/Lección magistral
Resolución de ejercicios y problemas

Actividades formativas

Las actividades formativas empleadas a lo largo del curso consisten en:

Clases teóricas
Clases prácticas
Estudio y trabajo en grupo
Estudio y trabajo individual
Tutorías
Seminarios y talleres
Revisión de exámenes y tareas
Evaluaciones

Planificación

Horas trabajo dirigido	60	40%
Horas trabajo compartido	30	20%
Horas trabajo autónomo	60	40%
Horas totales	150	100%

Evaluación

El procedimiento de evaluación de la asignatura en que se integran los recursos desarrollados es el siguiente:

GENERALIDADES:

Se utilizará una evaluación continua con el fin de que el aprendizaje del estudiante se realice a lo largo del curso. De dicha manera, el resultado final de la evaluación del estudiante comprenderá todo el trabajo que este haya realizado.
Se realizará un examen final donde se valorará el esfuerzo de razonamiento científico utilizado para resolver las diferentes cuestiones del examen. Dicho examen tendrá un peso en la calificación final de hasta un 75%.

La evaluación continua, las actividades realizadas tanto durante las clases teóricas como de las clases prácticas, así como el trabajo desarrollado en los seminarios comprenderá el resto de la nota hasta completar el 100%. Un 5% de esta nota se podrá utilizar para el seguimiento de las tutorías que los estudiantes realicen a lo largo del curso.

Las Prácticas de Laboratorio incluirán la presentación, a su finalización, de un Cuaderno de Prácticas en el que se describirán las prácticas realizadas, los resultados obtenidos y la interpretación de los mismos, así como las observaciones que el/la estudiante crea pertinente reseñar. La calificación de las actividades prácticas provendrá de la observación directa del estudiante en el laboratorio o en el aula de informática, así como de la evaluación de los guiones elaborados por el mismo a partir del trabajo desarrollado a lo largo de dichas prácticas.

Las actividades tendrán un peso del 20%.

EVALUACIÓN DEL BLOQUE TEÓRICO-PRÁCTICO:

Evaluación de la asignatura

La asignatura puede superarse mediante evaluación continua, acumulando hasta 100 puntos a lo largo del curso por la realización de actividades puntuables (puntuación mínima para aprobar la asignatura: 50 puntos). Alternativamente, se tendrá en cuenta exclusivamente la puntuación del examen final (hasta 50 puntos; puntuación mínima para aprobar la asignatura: 25 puntos). La calificación final de la asignatura será la que más favorezca al alumno de las dos mencionadas.

Los alumnos suspensos o no presentados conservarán para convocatorias posteriores la puntuación acumulada mediante evaluación continua, salvo que deseen voluntariamente renunciar a ella, decisión que deberán comunicarle al profesor al comenzar el curso.

Evaluación de la teoría

Se realizará un examen que será calificado entre 0 y 50 puntos. Incluirá 35 preguntas, cada una de ellas con 4 respuestas alternativas. Se concederá un punto por cada pregunta respondida correctamente. Se descontarán 0,33 puntos por cada respuesta errónea. Las preguntas no respondidas no puntuarán negativamente.

El examen también incluirá dos problemas, cada uno de los cuales será puntuado con hasta 7,5 puntos. Los errores cometidos en la resolución de estos problemas no serán penalizados. Aunque se suministrará al alumno papel para facilitarle el desarrollo de sus soluciones a los problemas, sólo se puntuarán las respuestas finales emitidas en cada apartado de la hoja de respuestas.

Evaluación de las prácticas de aula (problemas)

Se concederán 1,5 puntos por cada problema bien resuelto, hasta un máximo de 30. El profesor otorgará a cada apartado de un problema una puntuación parcial de 0, 0,5 o 1. Para obtener la puntuación global de un problema se sumarán las parciales y se dividirá el resultado por el número de apartados, aplicando redondeo al alza de la segunda cifra decimal, salvo cuando ésta sea cero.

Aquellos alumnos cuyas hojas de respuesta sean seleccionadas por el profesor para su defensa en público y no estén presentes en el aula perderán 30 puntos de su calificación global de la asignatura. También perderán 30 puntos quienes a juicio del profesor se manifiesten incapaces de defender mínimamente las propuestas recogidas en sus hojas de respuestas.

Evaluación de las prácticas de laboratorio

Se concederán hasta 10 puntos por asistencia a las clases de prácticas (0,5 punto por hora de clase). Se realizará un examen de prácticas, a la vez que el de teoría, que constará de 10 preguntas con respuestas alternativas y será puntuado con hasta 10 puntos. Se descontarán 0,33 puntos por cada respuesta errónea. Las preguntas no respondidas no puntuarán negativamente.

Publicidad de la evaluación las actividades puntuables

Las calificaciones obtenidas por resolución de problemas se publicarán un día después de la discusión de cada serie. Las correspondientes a la asistencia a prácticas de laboratorio se publicarán inmediatamente después de su impartición al último grupo de prácticas. Las de la parte de preguntas con respuestas alternativas de los exámenes de teoría y prácticas se publicarán el mismo día de la celebración del examen, y las de la parte de problemas, dos días después.

Revisión de calificaciones

La revisión de las calificaciones de las series de problemas se hará según el calendario que se publicará a este efecto. La de los exámenes de teoría y prácticas se realizará en fecha que también se anunciará con antelación suficiente, en la Sala de reuniones del Departamento de Biología Aplicada (edificio Vinalopó). No se admitirán en ningún otro momento consultas acerca de la forma en que se ha evaluado una actividad puntuable.

Ausencias

Quienes falten al examen, sea cual sea la causa, serán considerados no presentados a todos los efectos. Quienes falten a alguna sesión de las prácticas de laboratorio por padecer una enfermedad o haber sido convocados a un examen de otra asignatura del Grado en Biotecnología no perderán la puntuación correspondiente. Esta exención se concederá una sola vez por alumno y previo envío por correo electrónico de un certificado médico o documento que demuestre la celebración del examen. La norma no se aplicará a las clases de problemas.

Profesorado

Nombre	E-mail
MICOL MOLINA, JOSE LUIS
PONCE MOLET, MARÍA ROSA
CANDELA ANTON, HECTOR

Materiales de aprendizaje

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Descarga de curso

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